尊龙凯时细胞培养指南

一、细胞培养条件

细胞名称：生长特性：贴壁生长
冻存条件：无血清冻存液
培养体系：基础培养基为1:1的MCDB105培养基（含最终浓度15g/L碳酸氢钠）与M199培养基（含最终浓度22g/L碳酸氢钠）的混合物，添加15%的优质胎牛血清及1%的双抗。

二、细胞处理

在收到细胞后，应将其培养至良好状态，灌满完全培养液并封闭瓶口，这是运输细胞的最佳方法。使用75%酒精对细胞瓶进行喷洒消毒后，放入超净工作台内进行严格的无菌操作。然后，细胞瓶应放置于37℃、5%CO2的培养箱中静置3-4小时以稳定细胞状态。在显微镜下观察细胞的生长情况，并对不同放大倍数进行拍照保存（建议40x, 100x, 200x各一张），前三天的照片将作为重要的售后依据，若未提供照片则默认认为收到的细胞状态良好。

三、细胞培养步骤

a. 细胞传代

当细胞汇合度未超过80%时，将培养瓶中的完全培养液收集至离心管中，保留5ml完全培养基并置于37℃、5%CO2的孵箱中培养；若细胞密度超80%，可进行传代，具体步骤如下：
1. 弃去培养上清，使用不含钙、镁离子的PBS清洗细胞1-2次。
2. 添加0.25%胰蛋白酶消化液约1-2ml至培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟后，观察细胞的消化情况；若细胞大部分变圆并脱落，迅速返回操作台轻轻敲击培养瓶，随后加入5ml以上完全培养基以终止消化。
3. 轻轻吹打细胞，使其完全脱落后吸出，再将细胞悬液转移至离心管中，在1000RPM条件下离心5分钟，去除上清液，补加1-2ml完全培养基进行重悬。
4. 将细胞悬液按1:2的比例分瓶传代（两个T25瓶），补充新的完全培养基至5-8ml/瓶，最后将其放入37℃、5%CO2的细胞培养箱中继续培养。

b. 细胞冻存

1. 细胞生长至覆盖培养瓶80%面积时，弃去T25培养瓶中的培养液，并用PBS清洗细胞一次；
2. 添加0.25%胰蛋白酶消化液约1ml至培养瓶中，在显微镜下观察，待细胞回缩变圆后加入5ml完全培养液以终止消化，轻轻吹打使细胞脱落，然后将悬液转移至15ml离心管中，1000rpm离心5分钟；
3. 弃去上清，加入1ml的无血清冻存液（货号：C7001），混匀后转移至冻存管中；
4. 将冻存细胞直接放入-80℃冰箱，若后期需转入液氮罐，则需在-80℃冰箱中存放24小时以上后再转入液氮罐。

四、细胞复苏

从液氮中取出冻存管（佩戴防护面具），快速置入37℃水浴中解冻，直至冻存管无结晶后，用75%的酒精擦拭管外壁；将冻存管中的细胞移至含5ml完全培养基的15ml离心管中，1000rpm离心5分钟；去除上清，利用5ml完全培养基重悬细胞，接种至T25培养瓶，并放置于37℃、5%CO2的细胞培养箱中继续培养；第二天更换为新鲜的完全培养基以继续培养。

五、注意事项

一些细胞贴壁不牢，运输过程中易发生细胞脱落，这是正常现象。如脱落较多，可将培养瓶中的所有培养液收集至离心管中以进行过渡培养，后期可依据实验结果进行对比。

六、售后条款

1）细胞出现问题，重发的情况包括：
- 运输过程中发生的细胞丢失、瓶身破损、培养液泄漏等。
- 如果收到细胞48小时内出现污染，需提供真实实验结果以核实。
- 常温发货的细胞静置24小时或干冰发货的细胞复苏后24小时未存活（需提供准确的细胞状态照片）。
- 如果在细胞复苏后或常温发货静置过程中出现污染，可以申请重发。
- 若细胞活性不足，请在收到后7天内提供实际实验结果，并用台盼蓝染色法进行鉴定。
- 收到细胞后的前三天请拍照记录，若3天后未告知情况，则视为产品合格。

2）不予重发的情况包括：
- 客户自己造成的细胞污染。
- 客户不当操作导致细胞状态不佳。
- 使用非推荐的细胞培养体系导致细胞状态不良。
- 未提供培养前三天的照片。
- 细胞在培养过程中经历其他处理。
- 收到细胞2天内未联系进行反馈。
- 具体情况将根据实际情况处理。

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